TOSOH TRCREADY-80 – SAUGUS, GREITAS, JAUTRUS IR SPECIFIŠKAS BŪDAS AKTYVIAI TUBERKULIOZEI DIAGNOZUOTI

Šių metų birželio 26–liepos 1 dienomis vykusiame Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centro surengtame unikaliame renginyje – Tarptautinėje Vilniaus už­krečiamųjų ligų savaitėje – dalyvavo daugiau nei 300 medikų ir mokslininkų iš 23 pasaulio šalių. Renginyje aptarta įrodymais pagrįsta sveikatos politika, gydymo ir diagnostikos gairės, tyrimų rezultatai ir geriausi kovos su užkre­čiamosiomis ligomis Europos regione praktikos pavyzdžiai. Pranešimus kon­ferencijoje skaitė Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO), Europos ligų kon­trolės ir prevencijos centro, kitų tarptautinių organizacijų atstovai ir pasau­lyje žinomi užkrečiamųjų ligų specialistai.

Viena renginyje nagrinėtų temų – tuberkuliozės (TB) infekcijos proble­matika ir jos sprendimo būdai. TB išlieka aktualia sveikatos problema pa­saulyje – 2014 metais užfiksuota 9,6 mln. naujų TB atvejų. Vaistams atsparių jos formų taip pat daugėja (2014 metais nustatyti 480 tūkst. MDR-TB atve­jų)1. To priežastis tikriausiai slypi pačioje bakterijos biologijoje. Ligos sukė­lėjas – Mycobacterium tuberculosis – plaučius ir kitus audinius infekuojantis aerobas, besidauginantis kas 15–20 val., nefagocituojamas mikrofagų ir la­bai atsparus daugeliui dezinfekantų, rūgščių, šarmų ir dažų. Liga užsikrečiama lašeliniu būdu per orą. Imlesni yra as­menys, kurių imunitetas yra nusilpęs.

TB gydyti ir suvaldyti svarbiausia yra kokybiška ir efektyvi jos diagnostika. Minėtame renginyje dalyvavęs lekto­rius Antonio Mazzarelli iš Nacionalinio infekcinių ligų instituto Lazzaro Spallanzani (Roma, Italija) pristatė praneši­mą Greitas RNR nustatymas: esminė tuberkuliozės diagnostikos naujovė. A. Mazzarelli sutiko atsakyti į kelis klausimus apie naująjį TB diagnostikos būdą.

Prieš daugiau nei 100 metų atrasta rūgštims atsparių bakterijų tepinėlio mikroskopija išlieka plačiausiai tai­komu diagnostikos metodu, kai įtariama TB. PSO tokiu atveju rekomenduoja atlikti nuo 2 (provokavus atsikosė­jimą) iki 3 (esant aktyviam skrepliavimui) tepinėlių. Pa­sėlis laikomas TB diagnostikos auksiniu standartu. Ko­kie, jūsų nuomone, šių metodų privalumai ir trūkumai?

Tepinėlis – greitas, nebrangus ir specifiškas metodas didelio sergamumo regionuose. Kai nėra geresnių alterna­tyvų – tai naudingas įrankis paprastas laboratorijas turin­čiose besivystančiose šalyse. Vis dėlto tokio tyrimo obje­ktyvumas labai priklauso nuo tyrėjo kompetencijos, mėgi­nio kokybės. Remiantis naujausiomis PSO rekomendaci­jomis, nebereikia kartoti tepinėlio, jei vienąkart mėginyje rasta mikobakterijų. Tačiau publikuotose mokslinėse apž­valgose teigiama, kad plaučių TB tepinėlio diagnostikos jautrumas svyruoja tarp 50–80 proc. visų teigiamų kultūrų, be to, tepinėlyje matomos mikobakterijos tik esant pakan­kamai bakterijų koncentracijai – >104 mikobakterijų/mL2.

Pasėlis jautresnis už tepinėlį, todėl gali būti, kad pacientas serga, nors jo tepinėlis neigiamas. Esant teigiamam tepinėliui, bet neigiamam pasėliui, infekuotumo TB klausimas diskutuo­tinas. Normali inhibicinė flora tepinėlyje gali klaidingai pri­minti M. tuberculosis. Tokiu atveju galima bandyti išauginti inhibitorius pasėlyje.

Kodėl reikalingi nauji TB diagnostikos metodai?

Greita ir tiksli M. tuberculosis komplekso (MTBK) su­keliamų infekcijų diagnostika yra svarbi optimaliam gydy­mui ir ligos plitimo prevencijai. Nors pasėlis išlieka auksi­niu standartu, jau išplėtotas ne vienas molekulinis TB di­agnostikos rinkinys (AccuProbe, InnoLiPA Mycobacteria, GeneXpert, GenoType Mycobacterium CM/AS, GenoType MTBC ir kt.), siekiant diagnostikos procesą pagreitinti, nes išauginti bakterijų kultūrą reikia daug laiko (kietoje terpėje tai trunka 15–60 dienų, skystoje – 7–42 dienas).

Kuo skiriasi naujieji molekuliniai TB diagnostikos metodai?

Visi nauji molekuliniai tyrimai remiasi nukleorūgščių nustatymu, tačiau jų taikiniai ir veikimo principai skiria- si. Pavyzdžiui, yra metodai, kurie ieško specifinės DNR sekos – taikinio – M. tuberculosis genome. Tai atliekama pasitelkiant polimerazės grandininę reakciją (PGR), jos variantą atvirkštinės transkripcijos PGR (angl. Reverse transcription polymerase chain reaction – RT-PCR), kil-pinės izoterminės amplifikacijos metodu (angl. Loop me- diated isothermal amplification – LAMP), atkarpos po- slinkio amplifikacijos (angl. Strand Displacement am- plification) ar ligazės grandininės reakcijos metodiko- mis. Tyrimai gali būti atliekami rankiniu būdu ar visiškai automatizuotai, kas yra brangu ir prieinama tik didelėms laboratorijoms. Yra metodikų, kaip taikinį naudojančių ribonukleorūgš- tis (RNR). Viena jų – naujas komercinis japonų kompani- jos TOSOH testas, paremtas transkripcijos ir atvirkštinės transkripcijos sukeltomis reakcijomis (angl. Transcription- Reverse Transcription Concerned Reaction – TRCR), TR-CReady-80.

Kas yra TRCReady-80 ir koks jo veikimo principas? Tai PGR molekulinis tyrimas tikruoju laiku, kurio metu vyksta RNR išskyrimas, dauginimas ir nustatymas. TRCR (transkripcijos ir atvirkštinės transkripcijos) reakcijų derinys ir INAF (angl. INtercalation Activating Flu- orescence probe) zondas su fluorescuojančia žyma įgalina ti- kruoju laiku vieno žingsnio metodu, greitai (per 40 min.) ir efektyviai izoterminėmis sąlygomis nustatyti M. tuberculo- sis RNR. Metodas paremtas šiais principais:

● RNR taikinio iškirpimas: oligonukleotidas (vadinamosios žirklės) komplimentariai prisijungia prie taikinio RNR ir iškerpa specifinę jos atkarpą. Tada veikia atvirkštinė AMV transkriptazė. Taip produkuojama RNR tokia pat nukleo- rūgščių seka 5' gale;

● vyksta atvirkštinė transkripcija: sintetinama dvigrandė DNR;

● transkripcinė RNR sintezuojama pasitelkus RNR polime- razę;

● amplikonų perdirbimas: sintezuota RNR turi tą patį 5’ galą, kaip nukirpta RNR, ir įeina į dauginimosi ciklą. Tai lemia RNR sintezę dideliais kiekiais;

● M. tuberculosis RNR nustatymas tikruoju laiku: INAF zon- das prisijungia prie susintetintos RNR ir sukelia fluorescen- ciją, fiksuojamą kaip M. tuberculosis buvimo mėginyje faktas.

Kokie yra TOSOH TRCReady-80 metodo privalumai? Galėčiau išskirti ne vieną privalumą. Pirma – tai saugi ir vi- siškai automatizuota sistema. Reakcijos vyksta su vienkartiniais reagentais, uždaruose mėgintuvėliuose, kurie apsaugo nuo gali­mos mėginio kontaminacijos.

Antra, tyrimas atliekamas itin greitai, nes rezultatai gauna­mi greičiau nei per 1 val. (palyginkite tai su pasėliu, kurio at­sakymo tenka laukti ir 2 mėnesius), vienu metu galima atlik­ti iki 8 tyrimų.

Trečia, sistema validuota įvairiems mėginiams. Tyrimui galima naudoti skreplius, bronchoalveolinio lavažo, pleu­ros skystį, skrandžio nuoplovas ir kitas medžiagas. Ma­žiausias reikalingas tiriamosios medžiagos kiekis – 200 μL.

Ketvirta, specifiškai apdoroti mėginiai gali būti šaldomi –20 °C temperatūroje, o tyrimas atliekamas vėliau.

Analizatorius yra nedidelis, su vartotojui draugiška sistema duomenims įvesti. Sistemoje naudojami tik 2 reagentai skirti išskyrimui ir detekcijai bei vienkartiniai antgaliai.

Reikėtų nepamiršti ir mokslinės pusės – metodas pasižymi itin dideliu jautrumu (92,0 proc.) ir specifiškumu (97,7 proc.). Šios sis­temos unikalumas nustatant M. tuberculosis RNR padidina tyrimo jautrumą bei tikimybę aptikti gyvybingų ląstelių, palyginti su kitais analizatoriais, veikiančiais DNR nustatymo pagrindu.

Mėginio rezultatai gali būti stebimi tikruoju laiku – fluores­cencijos kitimas matomas atliekant tyrimą. Pateikiamas galuti­nis rezultatas tiksliai nurodo, ar mėginyje yra aptiktas M. tuber­culosis kompleksas (tyrimo atsakymas teigiamas), ar nėra (nei­giamas). Tyrimo patikimumui ir validumui užtikrinti reakcijų metu taip pat yra naudojamos teigiama ir neigiama kontrolės.

Ar buvo atlikti TRCReady-80 efektyvumo, patikimu­mo, validumo tyrimai, palyginti jį su kitomis diagnostikos galimybėmis?

Taip, Romoje atlikome tyrimą, palyginome šio naujo mole­kulinio metodo efektyvumą su TB diagnostikos auksiniu stan­dartu – pasėliu ir rūgštims atsparių bakterijų (angl. acid-fast bacilli – AFB) tepinėliu.

2015 metų lapkričio–2016 metų gegužės mėnesiais iš 378 pacientų surinkome 978 kvėpavimo takų mėginius (skreplių, bronchoalveolinio lavažo skysčio ir provokuotų skreplių). Jie analizuoti TRCReady-80Tosoh Bioscience, Tokio, Japan metodika, visiems atlikti skystos ir kietos terpės pasėliai bei tepinėliai.

Mūsų tyrimo rezultatai rodo, kad didžiausias tyrimo jautru­mas (97,29 proc.) pasiektas naudojant TOSOH TRCReady-80 ir 2 tepinėlius. Visais atvejais tyrimas buvo 100 proc. specifiškas. TOSOH TRCReady-80 yra validus TB diagnostikos meto­das, t. y. tinkama ir adekvati alternatyva pasėliui.

Kokias galėtumėte pateikti apibendrinančias išvadas?

Remiantis mūsų tyrimo rezultatais, TOSOH TRCReady-80 sistema pranašesnė jautrumu, specifiškumu, automatizuotumu, naudojimo paprastumu, greičiu ir saugumu. Šiuo metu ją nau­doti rekomenduojama norint greitai nustatyti M. tuberculosis kompleksą, įtariant respiracinę TB formą.

M. tuberculosis lemia didelį žmonių sergamumą, o greitas jos nustatymas svarbus laiku suteikiamam gydymui ir ligos pli­timo prevencijai. Remiantis preliminariomis išvadomis, mūsų siūlomas sutrumpintas TB diagnostikos algoritmas (2 tepinė­liai ir 1 molekulinis testas tiriant 2 atskirus kvėpavimo takų mėginius) galėtų būti naudingas didesnėje pacientų populiaci­joje kaip greitesnė alternatyva klasikiniam algoritmui (3 tepi­nėliai 3 skirtinguose mėginiuose), kartu išvengiant nereikalin­gos pacientų izoliacijos.

TOSOH TRCReady-80 yra naujoviškas testas, suteikiantis galimybę vienu žingsniu amplifikuoti ir tikruoju laiku nustaty­ti MTBK RNR be jokių papildomų procedūrų.

Dėkojame už pokalbį.

Parengė Lina Simanaitienė, Karoliniškių poliklinika

Šaltinis: Nr. 1 (10), 2016 INFEKCINĖS LIGOS ŽURNALO „INTERNISTAS“ PRIEDAS