Baltymų išskyrimo ir išgryninimo metodai
Norint išskirti individualius baltymus iš biologinių struktūrų (audinių, organų, ląstelių kultūrų), reikia atlikti daug veiksmų:
– biologinės medžiagos smulkinimą, ląstelių membranų ardymą;
– baltymų organelių frakcionavimą (skirstymą);
– baltymų ekstrahavimą (jų ištirpimą);
– individualų baltymų išskyrimą.
Biologinės medžiagos ardymas. Šiam procesui naudojama audinių homogenizacija, pakaitinio atšaldymo ir atšildymo procedūros, ląstelių poveikis ultragarsu. Suardžius audinius, netirpios dalys pašalinamos jas centrifuguojant. Vėliau homogenatas centrifuguojamas įvairiu greičiu ir frakcionuojamas (skirstomas). Gaunamos frakcijos, turinčios ląstelių branduolių, mitochondrijų, ir kitų organelių bei supernatanto (skysčio, kuriame yra tirpių ląstelės baltymų).
1. Baltymų ekstrahavimas (išskyrimas). Jeigu tiriamas baltymas yra stipriai sujungtas su tam tikromis ląstelės struktūromis, jį reikia išskirti į skystį. Hidrofobinei sąveikai tarp baltymų ir membranų lipidų ardyti naudojami detergentai. Dažniausiai naudojamas tritonas X-100 arba natrio dodecilsulfatas.
2. Nebaltyminių medžiagų iš tirpalo pašalinimas (nukleorūgščių, lipidų ir kt.) atliekamas, naudojantis jų fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis. Lipidai lengvai pašalinami, panaudojus organinius tirpiklius, pvz., acetoną. Tačiau tai neturi užtrukti, nes acetonas gali denatūruoti tam tikrus baltymus. Nukleorūgštys nusodinamos, į tirpalą pridėjus streptomicino.
Baltymų konformacija yra labili, todėl reikia vengti baltymų denatūruojančio poveikio. Taigi baltymai išskiriami ir išgryninami, esant žemai temperatūrai.
Pirmiausia iš tirpalo reikia pašalinti nereikalingus baltymus, kurie labai skiriasi nuo išskiriamo baltymo fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis. Toliau taikomi vis tikslesni baltymų išskyrimo metodai:
– Baltymų gryninimas, pasirenkamas denatūracijos būdu. Daugelis baltymų denatūruoja ir iškrinta nuosėdomis trumpalaikės 50–70 °C temperatūros metu.
– Išsūdymas remiasi jų išskirtiniu tirpumu įvairios koncentracijos druskų tirpaluose. Šarminių ir žemės šarminių metalų druskos baltymus nusodina grįžtamojo nusodinimo būdu, t. y. juos pašalinus baltymai vėl ištirpsta ir turi natyvias savybes.
Dažniausiai išsūdyti naudojamos įvairios amonio sulfato (NH4)2SO4 koncentracijos.
– Gelfiltracija. Šis metodas paremtas tuo, kad medžiagos skirtingos molekulinės masės skirtingai pasiskirsto tarp judrios ir nejudrios chromatografinės kolonėlės fazių.
– Ultracentrifugavimas taip pat paremtas baltymų skirtinga molekuline mase. Sedimentacijos greitis proporcingas jų molekulinei masei. Ultracentrifugavimo metu mėgintuvėlyje baltymai pasiskirsto pagal molekulinę masę.
– Baltymų elektroforezė remiasi tuo, kad esant tam tikrai pH ir tirpalo joninei jėgai elektriniame lauke, baltymai juda greičiu, proporcingu jų suminiam krūviui. Baltymai, turintys neigiamą krūvį, juda anodo (+) link, o teigiamą – katodo (–) link.
– Jonų mainų chromatografija, kaip ir elektroforezė, remiasi suminio krūvio skirtingumu. Naudojami polimerai, turintys skirtingo krūvio funkcines grupes (jonų mainų). Skiriami teigiamą krūvį turintys polimerai (dažniausiai dietilaminoetilceliuliozė, DERE, turinti katijonų grupių) ir neigiamą krūvį turintys polimerai (dažniausiai karboksimetilceliuliozė).
Dietilaminoetilceliuliozė
– Giminingumo (afininė) chromatografija remiasi skirtinga baltymų sąveika su ligandais, kurie yra pritvirtinti (imobilizuoti) prie kieto nešiklio. Ligandai gali būti substratas arba kofermentas. Prie ligandų jungiasi tik baltymas. Ši sąveika yra specifinė. Visi kiti baltymai patenka į eliuatą. Giminingumo (afininė) chromatografija pasižymi dideliu specifiškumu ir išskiriamą baltymą leidžia išgryninti tūkstančius kartų.
Šaltinis | Dažniausiai vartojamų biomedicinos terminų ir sąvokų aiškinamasis žinynas | Lietuvos sveikatos mokslų universitetas | Akademikas Profesorius Antanas Praškevičius, Profesorė Laima Ivanovienė